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技術(shù)文章
在應(yīng)用酵母雙雜交載體時常遇到的問題分析
  酵母雙雜交載體應(yīng)用中常遇到的問題一是假陽性較多,二是轉(zhuǎn)化效率偏低。所謂假陽性就是:在待研究的兩個蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下,報告基因被激活。
 
  主要原因是由于BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用,或者這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結(jié)合,則也可單獨激活報告基因的表達(dá)。
 
  因此,為排除假陽性就需要作嚴(yán)格的對照試驗。應(yīng)對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定。目前幾個公司推出的酵母雙雜系統(tǒng)都采用了多個報告基因,且每個報告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同,這可減少大量的假陽性。
 
  另外,報告基因通常整合到染色體上,可以使基因表達(dá)水平穩(wěn)定,消除了由于質(zhì)??截悢?shù)變化引起基因表達(dá)水平波動而造成的假陽性。
 
  即使根據(jù)嚴(yán)格的對照實驗證明確實發(fā)生了蛋白間的相互作用,還應(yīng)對以下方面進(jìn)行分析:
 
  (1)這種相互作用是否會在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生,即這一對蛋白在細(xì)胞的正常生命活動中是否會在同一時間表達(dá)且定位在同一區(qū)域。
 
  (2)某些蛋白如是依賴于遍在蛋白的蛋白酶解途徑的成員,它們具有普遍的蛋白間的相互作用的能力。
 
  (3)一些實際上沒有任何相互作用的但有相同的模體(motif)如兩個親a-螺旋的蛋白質(zhì)間可以發(fā)生相互作用。十年來,酵母雙雜交技術(shù)一直在消除假陽性方面不斷改進(jìn),并且已取得較好的效果〔2,3〕。
 
  在酵母雙雜交的應(yīng)用中有時也會遇到假陰性現(xiàn)象。所謂假陰性,即兩個蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用,但報告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測不出來
 
  〔4〕。造成假陰性的原因主要有兩方面:
 
  一、是融合蛋白的表達(dá)對細(xì)胞有毒性。這時應(yīng)該選擇敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。
 
  二、是蛋白間的相互作用較弱,應(yīng)選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。目前假陰性現(xiàn)象雖不是實驗中的主要問題,但也應(yīng)予以重視。
 
  轉(zhuǎn)化效率是酵母雙雜交文庫篩選時成敗的關(guān)鍵之一,特別是對低豐度cDNA庫進(jìn)行篩選時,必須提高轉(zhuǎn)化效率。
 
  轉(zhuǎn)化時可采用共轉(zhuǎn)化或依次轉(zhuǎn)化,相比之下共轉(zhuǎn)化省時省力。更重要的是如果單獨轉(zhuǎn)化會發(fā)生融合表達(dá)蛋白對酵母細(xì)胞的毒性時,共轉(zhuǎn)化則可以減弱或消除這種毒性。一種更有效的方法是將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉(zhuǎn)入不同接合型的單倍體酵母中,通過兩種接合型單倍體細(xì)胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個二倍體細(xì)胞。
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